Mit der Entwicklung der genetischen Rekombinationstechnologie können mehr und mehr Proteine ​​in exogenen Wirtszellen exprimiert werden. In dem Prozess der Expression führt jedoch eine inkorrekte Faltung zur Aggregation von Protein, um einen Einschlusskörper zu bilden. Zum einen können wir die Bildung von Einschlusskörpern vermeiden, indem wir die Kulturbedingungen von vorgeschalteten Zellen verändern, wie zum Beispiel die Expressionstemperatur senken, die Kulturzeit reduzieren und die Konzentration des Induktors verringern. Wenn die Situation jedoch nicht geändert werden kann, muss der Einschlusskörper gereinigt werden. undGuanidinhydrochloridspielt eine große Rolle bei der Reinigung des Einschlusskörpers.

(1) Zellen brechen

Die Bakterien wurden zur Zentrifugation gesammelt, um rohe Einschlusskörper zu erhalten.

(2) Waschen von Einschlusskörpern

Die Einschlusskörper werden mit einem Puffer gewaschen, der eine geringe Konzentration an Denaturierungsmittel (wie etwa 2 mM Harnstoff) oder kein Denaturierungsmittel enthält, um einen Teil des Heteroproteins zu entfernen, und der gereinigte Einschlusskörper wird durch Zentrifugation erhalten.

(3) Auflösung von Einschlusskörpern

die gereinigten Einschlußkörper werden unter Verwendung eines Puffers, der eine hohe Denaturierungskonzentration enthält, wie etwa 8 m Harnstoff oder 6 m Guanidinhydrochlorid, solubilisiert.

Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid (cas 50-01-1) haben unterschiedliche Fähigkeiten, Einschlusskörper aufzulösen. Harnstoff und Guanidinhydrochlorid sind mittelaktive Denaturierungsmittel, die starke reversible denaturierende Effekte auf die Wasserstoffbindung von Einschlusskörpern haben, aber die Fähigkeit von Harnstoff ist langsamer und schwächer als die von Guanidinhydrochlorid. die erforderliche Konzentration von Harnstoff beträgt üblicherweise 8 m, was eine schlechte Auflösungswirkung auf etwa ein Drittel der Proteineinschlußkörper hat, und die Löslichkeit beträgt 70% ~ 90%; Während die Konzentration von Guanidinhydrochlorid normalerweise 6 m beträgt und die meisten Einschlusskörper lösen kann, beträgt die Auflösungskapazität über 95%.

(4) Renaturierung und Reinigung

die gelösten Einschlusskörper können vor der Reinigung durch Verdünnung oder Dialyse renaturiert werden; oder gereinigt und dann renaturiert. alternativ wird das gelöste Einschlusskörperprotein einer Rückfaltung an der Säule unterzogen, um gleichzeitig eine Renaturierung und Reinigung zu erreichen. im allgemeinen können Molekularsieb (sec), Metallionenchelatchromatographie (ni² & spplus;), Ionenaustausch (iex) und hydrophobe (hic) hohe Denaturierungsmittelkonzentrationen tolerieren, so daß verschiedene chromatographische Techniken für die Rückfaltung an der Säule verwendet werden können. es ist jedoch zu beachten, ob die hohe Konzentration des Denaturierungsmittels oder anderer Komponenten im Puffer die Wechselwirkung zwischen dem Protein und dem Füllstoff beeinflusst.

(5) Erkennung und Analyse

Schließlich wird die erhaltene Probe einem Nachweis und einer Analyse unterzogen, um zu sehen, ob ein natürliches Protein erhalten wird. Zu den allgemeinen Nachweisverfahren gehören der Nachweis biologischer Aktivität, Circulardichroismus, dynamische Lichtstreuung oder Gelfiltration, Umkehrphasenchromatographie und so weiter.

Die Renaturierung von Einschlusskörpern ist ein sehr komplizierter Prozess und unterliegt vielen Faktoren. Die Konzentration der verschiedenen Reagenzien und Proteine ​​im Experiment, die Betriebstemperatur und Renaturierungszeit, die Zusammensetzung des Puffers und der pH-Wert sind für die experimentellen Ergebnisse entscheidend. obwohl Guanidinhydrochlorid Nachteile wie hohe Kosten, Ausfällung unter sauren Bedingungen, Störung der Proteinionenaustauschchromatographie nach der Renaturierung beim Auflösen der Einschlußkörper aufweist, ist seine Löslichkeit stark und verursacht keine kovalente Modifikation des rekombinanten Proteins.