Proteine ​​liegen typischerweise in komplexen Mischungen in Geweben oder Zellen vor und erfordern daher eine Reinigung bei vielen experimentellen Anwendungen, wie Strukturuntersuchungen und biochemischen In-vitro-Assays. Proteinreinigung basiert auf ihren unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften, um sich von den Rohmaterialien zu trennen, um den Zweck zu erreichen, die meisten funktionellen Proteine ​​zu erhalten. Unter ihnen hat die Protein-gereinigte Lösung eine entscheidende Rolle gespielt, welche Inhaltsstoffe werden dann in der Lösung benötigt?

Puffersystem

Proteine ​​sollten in einer guten Pufferumgebung gehalten werden, um irreversible Auswirkungen auf den Proteinfaltungsstatus, die Löslichkeit und Aktivität zu verhindern. biochemische Experimente verwendeten üblicherweise einen pH-Wert von 7,4, aber in Proteinreinigungsexperimenten sollte auch der isoelektrische Punkt des Proteins berücksichtigt werden. Im isoelektrischen Punkt existieren die Proteinmoleküle in Form von Zwitterionen mit gleichen positiven und negativen Ladungen und einer Nettoladung von Null. ihre Teilchen können leicht kollidieren und sich zu Präzipitaten zusammenlagern. Daher sollte der pH-Wert entsprechend dem isoelektrischen Punkt des Proteins eingestellt werden. Ein guter Puffer muss die folgenden Eigenschaften aufweisen:

gute Verträglichkeit mit anderen gelösten Stoffen.

Gemeinsames Puffersystem sind in der folgenden Tabelle gezeigt:

Reduktionsmittel

Wenn das Protein Cysteinreste enthält, kann eine Oxidation zwischen Cysteinresten eine Proteinaggregation verursachen. In diesem Fall ist es oft notwendig, dem Puffer ein Reduktionsmittel zuzusetzen. üblicherweise verwendete Reduktionsmittel sind \u0026 bgr; -Mercaptoethanol (Bme), Dithiothreitol (dtt) und Tris- (2-formylethyl) phosphinhydrochlorid (Tcep-hcl). bme enthält eine Mercaptogruppe, die die schlechteste Reduzierbarkeit aufweist und nur 2 bis 3 Tage aufrechterhalten kann. dtt hat zwei Mercaptogruppen, die 3 ~ 7 Tage stärker sind als bme. die reduktionsfähigkeit von tcep ist stärker als die von bme und dtt, seine rolle kann für 2 ~ 3 wochen aufrechterhalten werden. TCEP hat nicht nur eine starke Reduktionsfähigkeit, eine hohe Selektivität, sondern ist auch in sauren oder alkalischen Bedingungen stabiler.

Proteaseinhibitor

Proteaseinhibitoren in einem weiten Sinn bezieht sich auf die Materialien, die mit der aktiven Stelle von Proteasemolekülen kombinieren können, so dass die Proteaseaktivität abnimmt oder sogar verschwindet, aber nicht das Enzymprotein denaturiert. es wird oft in den frühen Schritten des Lysepuffers und des Reinigungsverfahrens zugegeben, um die Enzymolyse des Zielproteins durch endogene Proteasen zu verhindern. übliche Proteaseinhibitoren sind:

Leupeptin-Serin- und Cystein-Protease-Inhibitoren;

Magen-inhibitorisches Polypeptid-Asparaginsäure-Protease-Inhibitor;

pmsf-Serin-Protease-Inhibitoren

es gibt andere Additive, wie den Metallchelator edta oder egta, die ca² \u0026 spplus; oder mg² \u0026 spplus; chelieren können, um zu verhindern, daß das Zielprotein durch die Metalloprotease abgebaut wird; Argininkinasen, die die Proteinstruktur stabilisieren und die Löslichkeit erhöhen; ionische Stabilisatoren, verbessern die Löslichkeit und so weiter.

Die Proteintrennung und -reinigung ist eine komplexe und wichtige Arbeit, die sich direkt auf den Erfolg der nachfolgenden Experimente auswirkt. Es gibt jedoch keine einzelnen oder eine Reihe von vorgefertigten Methoden, um ein einzelnes Protein aus einer komplexen Mischung zu extrahieren, so dass es in der Praxis für den Experimentator auch notwendig ist, die Bedingungen zu erkunden, um den geeignetsten Weg zu finden, um hochreine Produkte zu erhalten. ..