Die rasche Entwicklung der Proteomik in den letzten Jahren hat uns zu einem tieferen Verständnis von Proteinfunktion und Interaktionsmechanismen geführt. Der Schlüssel zum Studium der Proteomik ist die Proteinextraktion. Dieses Papier wird die Extraktion von Gesamtprotein aus adhärenten Zellen, suspendierten Zellen und Geweben vorstellen.

Extraktion von Gesamtprotein (tf) aus adhärenten Zellen

Vorbereitung von Lysat (Ph 8,5-9,0): 50 mm Tris-Hcl, 2 mm Edta, 100 mm Nacl, 0,5% Triton x-100, pH-Wert auf 8,5-9,0 einstellen; 100 μg / ml Lysozym, 1 μl / ml Protease-Inhibitor pmsf in die Lösung geben.

Ohne Behandlung von Drogen:

(1) das Kulturmedium sorgfältig verwerfen und die Flasche auf das saugfähige Papier auf den Kopf stellen, um das Kulturmedium zu absorbieren;

(2) Die Zellen wurden mit 3 ml vorgekühlter Pbs (0,01m ph 7,2 bis 7,3) gewaschen und die Waschungen wurden verworfen, dreimal wiederholt, dann den Kolben auf Eis gelegt;

(3) Zugabe von Lyse-Lösung, Lysieren auf Eis für 30min;

(4) Die Zellen wurden mit einem sauberen Schaber auf eine Seite des Kolbens geschabt und dann mit einer Pipette zum Zentrifugenröhrchen entfernt;

(5) Zentrifugation für 5min bei 4 ° C und 12.000 U / min;

(6) Der Überstand wurde in das Zentrifugenröhrchen überführt und bei -20 ° C gelagert.

Mit Behandlung von Drogen:

Aufgrund der Auswirkungen von Drogen würden einige Zellen in die Lösung fallen, so dass auch Zellen im Kulturmedium zusätzlich zu dem obigen Vorgang gesammelt werden sollten:

(1) das Kulturmedium in das Zentrifugenröhrchen geben, 5min bei 2500 U / min zentrifugieren;

(2) den Überstand verwerfen, eine gewisse Menge Pbs hinzufügen und sanft blasen, um ihn mit einer Pipette zu waschen und dann 5min zu zentrifugieren, einmal wiederholt;

(3) den Überstand verwerfen, Lyse-Lösung hinzufügen und auf das Eis für 30min legen;

(4) gemischt mit dem vorherigen Lysat, Zentrifugation für 5min bei 4 ℃ und 12.000 U / min, nehmen Sie den Überstand in der Zentrifugenröhre und bei -20 ℃ gelagert.

Extraktion von Gesamtprotein aus Suspensionszellen

(1) wurden die Suspensionszellen ausgefällt, bei 2500 U / min für 10 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen;

(2) Zugabe eines Vorkohlenprotein-Extraktionsreagens, das Inhibitor enthält;

(3) schüttelt es für 15min sanft;

(4) Zentrifugation bei 14.000 U / min für 15min, entsorgt den Niederschlag und überträgt den Überstand sofort in ein neues Zentrifugenröhrchen.

Extraktion von Gesamtprotein in Geweben

(1) eine kleine Menge an Gewebe wird in einen 1 ~ 2ml Homogenisator gegeben, das Gewebe in Stücke so klein wie möglich geschnitten;

(2) 400 μl Single Detergens-Lyse-Lösung im Homogenisator hinzufügen, homogenisieren, Eisbad;

(3) die Organisation so gebrochen wie möglich machen;

(4) Lyse für 30min, wurde das Lysat in ein Zentrifugenröhrchen überführt, bei 12000 U / min und 4 ℃ für 5 min zentrifugiert, und der Überstand wurde im Zentrifugenröhrchen bei -20 ℃ gelagert.

Proteinprobenextraktion ist Voraussetzung für die anschließende Analyse. Die ideale Methode der Proteintrennung sollte alle Proteine ​​so weit wie möglich einschließen, umweltfreundlich und die Nachverarbeitung vereinfacht werden. Unterschiedliches System, unterschiedliche Methode, also sollten wir die passende Methode wählen, um die besten Analyseergebnisse zu erhalten.

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