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die unvollständige Übertragung von Protein in Wb? Kappen können Ihnen helfen! 2018-11-16 17:57:01

Im Western Blot (WB) gab es immer verschiedene Probleme:
  • unvollständige Übertragung von Protein?
  • hoher Hintergrund?
  • keine positiven Bänder?

......

Im Folgenden werden wir die möglichen Gründe für das Problem des ungenügenden Transfers von Proteinen mit entsprechenden Lösungen erläutern und hoffen, dass Ihnen dies beim Versuch gelingen kann.



1. Warum ist der Transfer von Protein erforderlich?


Western Blot ist eine Methode, bei der Proteine ​​auf eine Membran übertragen und dann mit einem Antikörper nachgewiesen werden. für bekannte Expressionsproteine ​​kann der entsprechende Antikörper als primärer Antikörper zum Nachweis verwendet werden, und das Expressionsprodukt des neuen Gens kann durch den Fusionsabschnitt des Antikörpers nachgewiesen werden.


Die durch Blatt getrennte Proteinprobe wird auf einen Festphasenträger (beispielsweise eine Nitrocellulosemembran) übertragen, und der Festphasenträger adsorbiert das Protein mit einer nichtkovalenten Bindung und kann den Typ des Polypeptids und seine biologische Aktivität aufrechterhalten. das Protein oder Polypeptid auf dem Festphasenträger wird als Antigen verwendet, und der entsprechende Antikörper ist immunreaktiv und wird dann mit dem Enzym oder dem Isotopen-markierten sekundären Antikörper umgesetzt, und das durch das spezifische Gen exprimierte Protein wird durch Farbentwicklung des Substrats oder nachgewiesen Autoradiographie.


2. den Grund und die Lösung der unvollständigen Übertragung


Gründe dafür
Lösungen
Der Film ist nicht völlig durchnässt
Verwenden Sie 100% Methanol durchlässige Membran
Molekulargewicht des Zielproteins beträgt weniger als 10,000
Wählen Sie eine Membran mit kleiner Porengröße, um die Übertragungszeit zu verkürzen
Der isoelektrische Punkt des Zielproteins ist gleich oder nahe dem pH des Transferpuffers
Versuchen Sie es mit anderen Puffern wien-Cyclohexyl-3-aminopropansulfonsäure(Kapseln) Puffer (ph 10,5) oder unter Verwendung von Puffern mit niedrigem pH-Wert wie Acetatpuffer
Die Methanolkonzentration ist zu hoch
Übermäßige Methanolkonzentration bewirkt, dass sich das Protein von den sds löst, wodurch es im Gel ausfällt, während das Gel schrumpft oder aushärtet, wodurch der Transfer von Proteinen mit hohem Molekulargewicht gehemmt wird. reduzieren Sie die Methanolkonzentration oder verwenden Sie stattdessen Ethanol oder Isopropanol
unzureichende Übertragungszeit
verlängerte Transferzeit für dicke Gele und Proteine ​​mit hohem Molekulargewicht


3. Vorbereitungsmethode fürKappen (cas 1135-40-6) Puffer


Bitte beachten Sie die folgende Tabelle (beide Konzentrationen von Puffer und Natriumhydroxid betragen 0,1 mol / l):


pH von Caps Puffer
Volumen (Caps
Volumen (Naoh)
6.8
250
0
10.0
218.3
31,7
10.5
178,6
71.4
10.8
156.3
93,7
11.2
138,9
111.1

die spezifische Arbeitsweise der Zubereitung ist: 0,1 mol / lKappenDie Pufferlösung wird zuerst in einem Messkolben hergestellt. Während des Konfigurationsprozesses muss der Puffer bei hoher Temperatur entwässert und in einem Exsikkator gekühlt werden. Gleichzeitig wird auch 0,1 mol / l Natronlauge formuliert. Gemäß der Formel in der obigen Tabelle kann eine Pufferlösung entsprechend ph hergestellt werden, und Natriumhydroxid wird hauptsächlich verwendet, um den pH-Wert einzustellen.


Western Blotting kann angewendet werden, um Zielproteine ​​aus Proteingemischen nachzuweisen, die Expression von Proteinen in Zellen oder Geweben quantitativ oder qualitativ zu bestimmen und die Protein-Protein-, Protein-DNA- und Protein-Rna-Wechselwirkungen anschließend zu analysieren. Der Filmtransfer ist die Basis von WB und seine Qualität ist der Schlüssel zum Erfolg von WB. Wir hoffen, dass die oben genannten Methoden Ihnen beim Transfor-Prozess helfen können.



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